家在荆州的桓玄很有势力，但没有兵权。这时朝廷上由司马道子和司马元显父子当权，宠信佞臣王国宝。王国宝想削弱地方藩镇势力，引起地方军阀不满。桓玄觉得有机可乘，便去对殷仲堪说：“王国宝与你们是仇敌，现在掌了大权，迟早会对你下手。你不如抢先一步，劝说兖、青两州刺史、前将军王恭起兵声讨王国宝，我们一齐响应，这可是齐桓公、晋文公一样的大事业啊！”殷仲堪犹豫，未敢答应，可不久接到了王恭来信，约殷仲堪与桓玄共同举事，匡正朝政。殷仲堪于是答应起兵。晋安帝隆安元年（397），王恭等起兵，司马道子连忙将王国宝杀了，王恭等于是收兵。司马道子很清楚桓玄在其中所起的作用，便封桓玄为建威将军、广州刺史，想把他调离荆楚。桓玄接受了任命，但并不去上任。第二年七月，王恭与豫州刺史庾楷又联合起兵，声讨司马道子的亲信江州刺史王愉及谯王司马尚之兄弟。殷仲堪与桓玄一齐响应。殷仲堪拨5000兵马，要桓玄与杨佺期两人为前锋。因王恭的部将刘牢之投顺了朝廷，这次事变无果而终。朝廷为离间殷仲堪、桓玄、杨佺期的关系，将殷仲堪贬为广州刺史，却任命桓玄为江州刺史、杨佺期为雍州刺史。这批人不听朝廷调动，汇集到寻阳（今江西九江县）推桓玄担任盟主。晋安帝隆元三年（399）十二月，朝廷加桓玄都督荆州四郡（即长沙、衡阳、湘东、零陵）军事。殷仲堪是荆州刺史，现在又命桓玄都督荆州四郡，事实上是有意制造矛盾。桓玄乘荆州水灾、仓库空竭之机攻打殷仲堪。殷仲堪兵败逃奔酂城（今湖北光化县），桓玄部将冯该在冠军城（今河南邓县西北）将殷仲堪抓获，逼令其自杀于柞溪。

《隋书·经籍志》录殷仲堪《论集》八十六卷、《文集》十二卷，《杂集》、《策集》和《常用字训》各一卷。清人马国翰辑《论语殷氏解》一卷，民国龙璋辑《字训》一卷。